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DNA重组实验技术总结

DNA重组技术，是分子的生物学研究生需要掌握的实验技术之一，DNA重组实验方法总结如下：一、实验目的体外连接获得重组分子，用于转化受体细胞。二、实验原理DNA重组技术是用内切酶分别将载体和外源DNA切开，经分离纯化后，用连接酶将其连接，构成新的DNA分子。外源DNA片段和质粒载体的连接反应策略有以下几种：1、带有非互补突出端的片段用两种不同的限制性内切酶进行消化可以产生带有非互补的粘性末端，这也是最容易克隆的DNA片段，一般情况下，常用质粒载体均带有多个不同限制酶的识别序列组...

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PCR仪使用参数设定注意事项

PCR仪使用参数设定注意事项PCR仪使用参数设定不正确会影响到PCR实验结果，这主要表现在温度、时间和循环次数上，如果温度参数设置过高，延伸时间不够都会对实验结果造成影响，下面谈谈使用PCR仪参数设定时的注意事项：一、温度和时间温度与时间的设置：基于PCR原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点。在标准反应中采用三温度点法，双链DNA在90～95℃变性，再迅速冷却至40～60℃，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至70～75℃，在TaqDNA聚合酶的作用下，使引物链沿模...

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一种通过改造CHO 细胞提升抗体产量的新技术

丙酮酸羧化酶是细胞质和线粒体代谢途径的重要元素，可以有效促进能量代谢。在CHO细胞中过表达酵母胞质丙酮酸羧化酶(PYC2)，可以增加丙酮酸流向TCA循环。增强的PYC2表达导致丙酮酸通量增加，从而使乳酸积累减少多达4倍，并显着增加细胞密度和培养寿命。有了这个结果，与亲本细胞相比，工程细胞的抗体表达显着提高了70%，产品质量也有所提高（约3倍）。通过PYC2工程改造提升细胞性能，在丙酮酸、葡萄糖、乳酸和细胞能量代谢方面具有均高于亲代细胞的各种优势。PYC2工程改造原理和方法在补...

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核酸酶切反应原理及注意事项

A载体和外源DNA的酶切一、实验目的学习和掌握核酸的酶切操作原理；通过酶切获得可进行体外重组的载体和外源DNA。二、实验原理限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上，并切割双链DNA。绝大多数限制酶识别长度为4至6个核苷酸的回文对称特异核苷酸序列(如EcoRⅠ识别六个核苷酸序列：5'-G↓AATTC-3')，有少数酶识别更长的序列或简并序列。Ⅱ类酶切割位点在识别序列中，有的在对称轴处切割，产生平末端的DNA片段(如SmaⅠ:5'...

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质粒DNA的提取实验方法和步骤

质粒DNA的提取实验方法和步骤一、实验目的通过本实验学习和掌握碱裂解法提取质粒的原理和步骤。二、实验原理从细菌中分离质粒DNA的方法都包括3个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细胞：分离和纯化质粒DNA。采用溶菌酶可以破坏菌体细胞壁，十二烷基磺酸钠(SDS)和TritonX-100可使细胞膜裂解。经溶菌酶和SDS或TritonX-100处理后，细菌染色体DNA会缠绕附着在细胞碎片上，同时由于细菌染色体DNA比质粒大得多，易受机械力和核酸酶等的作用而被切断成不同大小的线性...

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